Igor Kłykociński

Wydział Biologii UW
Koło Naukowe Biologii Molekularnej UW

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych to zjawisko spontanicznego parowania zasad azotowych należących do różnych nici kwasów nukleinowych. Może zachodzić pomiędzy dwoma cząsteczkami DNA, RNA lub też DNA i RNA, które charakteryzujących się względem siebie pełną lub częściową komplementarnością. W biotechnologii ma zastosowanie głównie w dwóch metodach, pozwalających na wykrywanie specyficznych sekwencji DNA oraz RNA:

• Technika Southern (Southern Blotting)→ zaprojektowana przez Edwina Southerna w 1975, pozwala na zlokalizowanie konkretnej sekwencji DNA po elektroforezie

• Technika Northern (Northern Blotting) → wymyślona przez Jamesa Alwine’a, Davida Kempa, oraz George’a Starka w roku 1977, umożliwia detekcję określonych sekwencji nukleotydów w RNA, najczęściej wykorzystywana jest w celu wykrycia mRNA, które powstaje w wyniku zachodzącej w komórkach transkrypcji (pozwala na określenie aktywności pojedynczych genów)

W przypadku obu metod wykorzystywane są sondy. Są to fragmenty kwasów nukleinowych, które mają zdolność łączenia się z badaną sekwencją docelową (pomiędzy nimi dochodzi do hybrydyzacji). Jednak by możliwe było wykrycie zajścia tego procesu, użyta sonda musi zawierać jakiś znacznik, który pozwoli na jej detekcję. W tym celu wykorzystuje się znakowanie fluorescencyjne, gdzie wykorzystuje się zmodyfikowane nukleotydy zawierające fluorofory (cząsteczki świecące w wyniku wzbudzenia światłem o określonej długości fali) oraz używane w większości przypadków znakowanie radioaktywne. Wówczas jeden z atomów znajdujących się w nukleotydzie składającym się na nić kwasu nukleinowego zostaje zastąpiony izotopem radioaktywnym, np. izotopem ³²P. Jako że radioaktywność to reakcja samorzutnej przemiany jednego jądra atomowego w inne, której zawsze towarzyszy emisja promieniowania, możliwe jest jej wykrycie przy zastosowaniu odpowiednich urządzeń pomiarowych. Główną zaletą znakowania radioaktywnego jest wysoka czułość detekcji, jednak posiada również wady, do których należą ograniczony czas zdatności sondy do użytku (wynikający ze zmniejszającej się ilości izotopu, będący skutkiem rozpadów promieniotwórczych, które zachodzą tym częściej im krótszy jest okres półtrwanie danego izotopu – dla wspomnianego ³²P jest to 14,3 dni) oraz konieczność stosowania środków ochronnych przed promieniowaniem.

Gdy mamy już sondę (często, w przypadku popularnych sekwencji, istnieje możliwość zakupienia gotowej) możemy przystąpić do przeprowadzenia detekcji kwasów nukleinowych. W przypadku techniki Southern najpierw należy przeprowadzić rozdział elektroforetyczny badanego DNA (na żelu agarozowym).

DNA znajdujące się na tym żelu (po przeprowadzonej elektroforezie) trzeba poddać denaturacji w odpowiednim buforze alkalicznym (bez przeprowadzonej denaturacji nasza sonda nie miałaby możliwości związania się z badanym DNA). Następnie należy przeprowadzić transfer DNA z żelu na odpowiednio przygotowany filtr (nitrocelulozowy lub nylonowy).

Po przeprowadzonym transferze, należy utrwalić przeniesione DNA za pomocą wysokiej temperatury lub przy użyciu promieniowa UV. Jednak zanim przystąpimy do hybrydyzacji sondy z naszym DNA, trzeba jeszcze przeprowadzić tzw. prehybrydyzację. Polega ona na umieszczeniu filtra po transferze w roztworze, którego składniki zablokują możliwość wiązania się kwasów nukleinowych z filtrem (sondy to przecież DNA lub RNA), pozwoli to na uniknięcie niespecyficznego wiązania się sondy. Częstym zabiegiem, mającym za zadanie zminimalizować tło, wynikające z hybrydyzacji sondy z losowymi cząsteczkami kwasów nukleinowych jest dodanie niehomologicznego DNA (nie posiadającego sekwencji podobnych do badanego przez nas), najczęściej jest to DNA ze spermy łososia.

Gdy przejdziemy przez te wszystkie etapy możemy w końcu przystąpić do właściwego procesu hybrydyzacji, kiedy wyznakowana sonda połączy się z DNA unieruchomionym na filtrze. Potem pozostaje nam tylko pozbyć się niezhybrydyzowanej sondy poprzez kilkukrotne płukanie w odpowiednich roztworach. Pozwala to na uzyskanie wyraźnego obrazu detekcji badanego DNA podczas wizualizacji hybrydyzacji.

Natomiast schemat postępowania w trakcie techniki Northern jest bardzo podobny do tego opisanego już wyżej w przypadku techniki Southern. Główne różnice polegają na zastosowaniu innego składu używanych roztworów oraz dodatku formaldehydu do żelu agarozowego. Dodatkowo należy zwracać szczególną uwagę by używane przez nas roztwory nie były zanieczyszczone RNazami, które mogłyby doprowadzić do degradacji badanego RNA, a w konsekwencji popsucia całego eksperymentu.

Oczywiście hybrydyzacja kwasów nukleinowych jest również używana w innych metodach badawczych niż dwie opisane powyżej. Należą do nich:

• DNA fingerprinting → wyizolowane DNA poddaje się trawieniu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, a następnie rozdziela się za pomocą elektroforezy i przenosi na odpowiedni filtr, gdzie łączy się z wyznakowaną sondą. Pozwala to uzyskać unikalny dla danego osobnika układ prążków DNA („genetyczny odcisk palca”), który ma zastosowanie np. w kryminalistyce.

• In situ hybridization → za pomocą tej metody możliwe jest wykrycie poszukiwanej sekwencji DNA oraz określenie jej pozycji w komórce.

Źródła:

• http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/hybrydyzacja

• http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Fluorescencyjna-hybrydyzacja-in-situ/

• https://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot

• https://en.wikipedia.org/wiki/Northern_blot

• Skrypt „Genetyka molekularna”,Uniwersytet Warszawski, 2003.

• Skrypt „Molekularne techniki analizy RNA”, Uniwersytet Warszawski, 2013.

• J. G. Wetmur 1976 Hybridization and Renaturation kinetics of nucleic acids Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 5:337-361.

• E. M. Southern 1975 Detection of Specific Sequences Among DNA Fragments Separated by Gel Electrophoresis J. Mol. Biol. 98:503-517.