Drukuj
Odsłony: 595

Adrian Macion

Zakład Genetyki Bakterii
Instytut Mikrobiologii
SKN Biologii Molekularnej
Uniwersytet Warszawski
Ten adres pocztowy jest chroniony przed spamowaniem. Aby go zobaczyć, konieczne jest włączenie w przeglądarce obsługi JavaScript.

Artykuł ten omawia jedno z zagadnień, które znajduje się w kursie "Epigenetyka" utworzonego w ramach projektu KNBM Open University.

Struktura chromatyny określa stan, w którym informacja genetyczna w postaci DNA jest zorganizowana w komórce. Ta organizacja genomu w precyzyjną zwartą strukturę ma duży wpływ na zdolność genów do aktywacji lub wyciszenia. Epigenetyka, pierwotnie zdefiniowana przez Waddingtona jako „interakcje przyczynowe między genami i ich produktami, które tworzą fenotyp”, obejmuje zrozumienie struktury chromatyny i jej wpływu na funkcję genów. Definicja Waddingtona początkowo odnosiła się do roli epigenetyki w rozwoju embrionalnym; jednak ponieważ epigenetyka jest zaangażowana w wiele różnych procesów biologicznych – jej definicja ewoluowała z biegiem czasu. Obecna definicja epigenetyki to "badanie dziedzicznych zmian w ekspresji genów, które zachodzą niezależnie od zmian w pierwotnej sekwencji DNA". Większość z tych dziedzicznych zmian powstaje podczas różnicowania i jest stabilnie utrzymywana przez wiele cykli podziału komórki, umożliwiając komórkom posiadanie odrębnej tożsamości przy jednoczesnym zachowaniu tej samej informacji genetycznej. Ta dziedziczność wzorców ekspresji genów jest utrzymywana przez modyfikacje epigenetyczne, które obejmują metylację zasad cytozyny w DNA, potranslacyjne modyfikacje białek histonowych, a także pozycjonowanie nukleosomów wzdłuż DNA. Uzupełnienie tych modyfikacji, łącznie określanych jako epigenom, zapewnia mechanizm różnorodności komórkowej poprzez regulowanie, do jakiej informacji genetycznej może uzyskać dostęp maszyneria komórkowa. Niewłaściwe utrzymanie dziedzicznych znaków epigenetycznych może skutkować nieprawidłową aktywacją lub zahamowaniem różnych ścieżek sygnałowych i prowadzić do stanów chorobowych, takich jak nowotwór.

Ostatnie postępy w dziedzinie epigenetyki wykazały, że ludzkie komórki nowotworowe, oprócz licznych zmian genetycznych, zawierają globalne nieprawidłowości epigenetyczne. Te genetyczne i epigenetyczne zmiany są kluczowe na wszystkich etapach rozwoju nowotworu. Genetyczne pochodzenie nowotworu jest powszechnie akceptowane; jednak ostatnie badania sugerują, że to zmiany epigenetyczne mogą być kluczowymi zdarzeniami inicjującymi w niektórych jego postaciach. Fakt, że aberracje epigenetyczne, w przeciwieństwie do mutacji genetycznych, są potencjalnie odwracalne i mogą zostać przywrócone do ich normalnego stanu za pomocą terapii epigenetycznej, czyni wszelkie badania epigenetyczne obiecującymi i istotnymi terapeutycznie.

Mechanizmy epigenetyczne w zdrowych komórkach

Chromatyna składa się z powtarzających się jednostek nukleosomów, które składają się z ~146 par zasad DNA owiniętych wokół oktameru czterech rdzeniowych białek histonowych (H3, H4, H2A i H2B). Mechanizmy epigenetyczne modyfikujące strukturę chromatyny można podzielić na cztery główne kategorie: (I) metylacja DNA; (II) kowalencyjne modyfikacje histonów; (III) mechanizmy niekowalencyjne, takie jak włączanie wariantów histonów i przebudowa nukleosomów; (IV) niekodujące RNA, w tym mikroRNA (miRNA). Te modyfikacje współpracują ze sobą, aby regulować funkcjonowanie genomu poprzez zmianę lokalnej dynamiki strukturalnej chromatyny, przede wszystkim regulując jej dostępność i zwartość. Wzajemne oddziaływanie tych modyfikacji tworzy "kod epigenetyczny”. Odmienne wzorce tych modyfikacji obecne w różnych stanach komórkowych służą jako strażnik tożsamości komórkowej, który pozwala utrzymać jej konkretny fenotyp w trakcie podziałów.

Metylacja DNA

Metylacja DNA jest prawdopodobnie najlepiej zbadaną modyfikacją epigenetyczną u ssaków. Zapewnia stabilny mechanizm wyciszania genów, który odgrywa ważną rolę w regulacji ekspresji genów i architektury chromatyny, w połączeniu z modyfikacjami histonów i innymi białkami związanymi z chromatyną. U ssaków metylacja DNA zachodzi głównie przez kowalencyjną modyfikację reszt cytozyny w dinukleotydach CpG. Dinukleotydy CpG nie są równomiernie rozmieszczone w ludzkim genomie, ale zamiast tego są skoncentrowane w krótkich, bogatych w CpG odcinkach DNA zwanych „wyspami CpG” i w regionach dużych sekwencji powtarzalnych (np. powtórzenia centromerowe, elementy retrotranspozonów, rDNA itp.). Wyspy CpG są preferencyjnie zlokalizowane na końcu 5' genów i zajmują ~60% ich promotorów. Podczas gdy większość losowo rozmieszczonych miejsc CpG w genomie jest zmetylowanych, większość wysp CpG zwykle pozostaje niemetylowana podczas rozwoju i w zróżnicowanych tkankach. Jednak niektóre promotory wyspowe CpG ulegają metylacji podczas rozwoju, co skutkuje długotrwałym wyciszeniem transkrypcji. Inaktywacja chromosomu X i imprinting genowy są klasycznymi przykładami naturalnie występującej metylacji wysp CpG podczas rozwoju organizmu. Stwierdzono również, że pewne specyficzne tkankowo metylowanie wysp CpG występuje w różnych tkankach somatycznych, głównie w genach ważnych z punktu widzenia różnicowania. W przeciwieństwie do tego, powtarzające się sekwencje genomowe, które są rozproszone w całym ludzkim genomie, są silnie zmetylowane, co zapobiega niestabilności chromosomalnej poprzez wyciszanie niekodującego DNA i transpozycyjnych elementów DNA. Metylacja DNA może prowadzić do wyciszenia genów poprzez zapobieganie lub promowanie rekrutacji białek regulatorowych do DNA. Na przykład może hamować aktywację transkrypcji poprzez blokowanie dostępu czynników transkrypcyjnych do miejsc wiązania, np. c-myc i MLTF. Alternatywnie, może zapewniać miejsca wiązania dla białek domeny wiążącej grupę metylową, które mogą pośredniczyć w represjonowaniu genów poprzez interakcje z deacetylazami histonowymi (HDAC). W związku z tym metylacja DNA wykorzystuje różnorodne mechanizmy do dziedzicznego wyciszania genów i niekodujących regionów genomowych.

Dokładne wzorce metylacji DNA znalezione w genomie ssaków są generowane i dziedzicznie utrzymywane dzięki współdziałaniu metylotransferaz de novo — DNMT3A i DNMT3B, które działają niezależnie od replikacji i wykazują równą preferencję zarówno dla niemetylowanego i hemimetylowanego DNA, jak i dla podtrzymującej metylotransferazy DNA — DNMT1, który działa podczas replikacji preferencyjnie metylując hemimetylowany DNA.

Podczas gdy rola metylacji promotora wyspowego CpG w wyciszaniu genów jest dobrze znana, znacznie mniej wiadomo na temat roli metylacji promotorów wyspowych innych niż CpG. Ostatnie badania wykazały, że metylacja DNA jest również ważna dla regulacji promotorów zawierających sekwencje inne niż wyspy CpG. Na przykład tkankowo-specyficzna ekspresja MASPIN, która nie zawiera wyspy CpG w swoim promotorze, jest regulowana przez metylację DNA. Podobnie, metylacja promotora Oct-4 w regionie niebędącym wyspą CpG silnie wpływa na jego poziom ekspresji. Ponieważ wyspy CpG zajmują tylko ~60% promotorów ludzkich genów, istotne jest wyjaśnienie roli metylacji wysp innych niż CpG, aby w pełni zrozumieć globalną rolę metylacji DNA w prawidłowej tkance. 

Kowalencyjne modyfikacje histonów

Białka histonowe, które składają się na rdzeń nukleosomu, zawierają globularną domenę C-końcową i nieustrukturyzowany ogon N-końcowy. N-końcowe ogony histonów mogą podlegać różnym potranslacyjnym modyfikacjom kowalencyjnym obejmującym metylację, acetylację, ubikwitylację, sumoilację i fosforylację na określonych resztach. Te modyfikacje regulują kluczowe procesy komórkowe, takie jak transkrypcja, replikacja i naprawa genomu. Zaproponowano uzupełnienie modyfikacji w celu przechowywania pamięci epigenetycznej wewnątrz komórki w postaci „kodu histonowego”, który określa strukturę i aktywność różnych regionów chromatyny. Modyfikacje histonów działają poprzez zmianę dostępności chromatyny lub rekrutację i/lub blokowanie białek efektorowych niehistonowych, które dekodują wiadomość zakodowaną przez wzorce modyfikacji. Mechanizm dziedziczenia tego kodu histonowego wciąż nie jest jednak do końca poznany.

W przeciwieństwie do metylacji DNA, modyfikacje histonów mogą prowadzić do aktywacji lub represji, w zależności od tego, które reszty są zmodyfikowane i rodzaju obecnych modyfikacji. Na przykład, acetylacja lizyny koreluje z aktywacją transkrypcji, podczas gdy metylacja lizyny prowadzi do aktywacji lub represji transkrypcji w zależności od tego, która reszta jest zmodyfikowana i od stopnia jej metylacji. Na przykład trimetylacja lizyny 4 na histonie H3 (H3K4me3) występuje w szczególności transkrypcyjnie aktywnych promotorach genów, podczas gdy trimetylacja H3K9 (H3K9me3) i H3K27 (H3K27me3) jest obecna w promotorach genów, które są wyciszone. Te dwie ostatnie modyfikacje razem stanowią dwa główne mechanizmy wyciszania w komórkach ssaków. Zidentyfikowano szeroki wachlarz aktywnych i represyjnych modyfikacji histonów, które stanowią złożoną sieć regulatorową genów, niezbędną dla fizjologicznej aktywności komórek. Badania obejmujące cały genom wykazujące różne wzorce lokalizacji znacznie pogłębiły naszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób te różnorodne modyfikacje działają wspólnie, regulując globalne wzorce ekspresji.

Specyficzne wzorce modyfikacji histonów są obecne w różnych typach komórek i proponuje się, że odgrywają kluczową rolę w określaniu tożsamości komórkowej. Na przykład embrionalne komórki macierzyste (ES) posiadają „dwuwartościowe domeny”, które zawierają współistniejące znaczniki aktywne (H3K4me3) i represywne (H3K27me3) na promotorach genów ważnych z punktu widzenia rozwoju. Takie domeny dwuwartościowe są tworzone przez aktywność dwóch krytycznych regulatorów rozwoju u ssaków: grupy polycomb, która katalizuje wyciszającą genom trimetylację H3K27 i jest niezbędna do utrzymania pluripotencji komórek ES poprzez wyciszanie genów specyficznych dla różnicowania komórki i potencjalnie grupy trithorax, która katalizuje aktywacja znacznika trimetylacji H3K4 i jest wymagana do utrzymania aktywnych stanów chromatyny. Przypuszcza się, że ta biwalencja zwiększa plastyczność fenotypową, umożliwiając komórkom ES ścisłą regulację ekspresji genów podczas różnych procesów rozwojowych. Zróżnicowane komórki tracą tę biwalencję i uzyskują sztywniejszą strukturę chromatyny, co może być ważne dla zachowania losu komórek podczas ekspansji i dojrzewania tkanek. Ta hipoteza jest poparta niedawnym odkryciem dużych skondensowanych regionów chromatyny zawierających represyjny znacznik H3K9me2, zwany „LOCKs”, w zróżnicowanych komórkach ES, które mogą utrzymywać wyciszanie dużych regionów genomowych w zróżnicowanych tkankach.

Wzorce modyfikacji histonów są dynamicznie regulowane przez enzymy, które dodają i usuwają kowalencyjne modyfikacje białek histonowych. Acetylotransferazy histonowe (HAT) i metylotransferazy histonowe (HMT) dodają odpowiednio grupy acetylową i metylową, podczas gdy HDAC i demetylazy histonowe (HDM) usuwają odpowiednio grupy acetylową i metylową. W ciągu ostatniej dekady zidentyfikowano szereg enzymów modyfikujących histony, w tym różne HAT, HMT, HDAC i HDM. Te enzymy modyfikujące histony oddziałują ze sobą, jak również z innymi mechanizmami regulacyjnymi DNA, aby ściśle powiązać stan chromatyny i transkrypcję.

Wzajemne oddziaływanie metylacji DNA i modyfikacji histonów 

Oprócz pełnienia indywidualnych ról, modyfikacje histonów i metylacja DNA oddziałują ze sobą na wielu poziomach, aby określić status ekspresji genów, organizację chromatyny i tożsamość komórkową. Oprócz bezpośredniej rekrutacji DNMT, HMT i demetylazy wpływają również na poziom metylacji DNA poprzez regulację stabilności białek DNMT. DNMT mogą z kolei rekrutować HDAC i białka wiążące grupy metylowe w celu wyciszenia genów i kondensacji chromatyny. Metylacja DNA może również kierować metylacją H3K9 przez białka efektorowe, takie jak MeCP2, tym samym ustanawiając represyjny stan chromatyny. Interakcje między maszynerią metylacji DNA a enzymami modyfikującymi histony dodatkowo zwiększają złożoność epigenetycznej regulacji ekspresji genów, która determinuje i utrzymuje tożsamość i funkcję komórki.

Pozycjonowanie nukleosomów i warianty histonów

Mechanizmy niekowalencyjne, takie jak przebudowa nukleosomów i zastąpienie kanonicznych białek histonowych wyspecjalizowanymi wariantami histonów, również odgrywają ważną rolę w regulowaniu aktywności genów przez strukturę chromatyny. Oprócz tego, że służą jako podstawowe moduły do pakowania DNA w komórce, nukleosomy regulują ekspresję genów poprzez zmianę dostępności regulatorowych sekwencji DNA do czynników transkrypcyjnych. Dane mapowania nukleosomów całego genomu dla różnych organizmów eukariotycznych ujawniają wspólny motyw organizacyjny z precyzyjnym rozmieszczeniem nukleosomów wokół promotorów genów, w porównaniu ze stosunkowo losowym wzorcem znalezionym w rdzeniu genów. Uważa się, że regiony wolne od nukleosomów (NFR) obecne na końcach 5' i 3' genów zapewniają miejsca składania i rozkładania maszynerii transkrypcyjnej. Utrata nukleosomu bezpośrednio przed miejscem startu transkrypcji jest ściśle skorelowana z aktywacją genu. Ponadto obecność NFR na promotorach genów o podstawowym poziomie transkrypcji koreluje z ich zdolnością do szybkiej aktywacji po stymulacji. W przeciwieństwie do tego, zamknięcie miejsca startu transkrypcji w NFR przez nukleosom wiąże się z represją genu. Modulacja NFR jest kierowana przez zależne od ATP kompleksy przebudowujące chromatynę, które modyfikują dostępność miejsc regulatorowych DNA zarówno poprzez przesuwanie, jak i usuwanie nukleosomów. Interakcja maszynerii przebudowy nukleosomów z metylacją DNA i modyfikacjami histonów odgrywa kluczową rolę w ustalaniu globalnych wzorców ekspresji genów i architektury chromatyny. 

Oprócz fizycznych zmian w pozycjonowaniu nukleosomów za pośrednictwem remodelerów chromatyny, włączenie konkretnych wariantów histonów (np. H3.3 i H2A.Z) do nukleosomów również wpływa na aktywność genów. W przeciwieństwie do głównych podtypów histonów, których synteza i włączanie są połączone z replikacją DNA w fazie S, warianty te są syntetyzowane i włączane do chromatyny przez cały cykl komórkowy. H3.3 i H2A.Z są ulokowane w promotorach aktywnych genów lub genów gotowych do aktywacji i mogą pośredniczyć w ich aktywacji poprzez zmianę stabilności całych nukleosomów. Włączenie H2A.Z może również przyczynić się do aktywacji genów poprzez ochronę chromatyny przed metylacją DNA. W komórkach ES H2A.Z znajduje się w jednym miejscu z biwalentnymi domenami, gdzie może pomagać w utrzymaniu kluczowych genów rozwojowych w stanie stabilnym. Podobnie jak histony kanoniczne, warianty histonów podlegają różnym modyfikacjom potranslacyjnym, które determinują ich lokalizację jądrową i funkcję. Na przykład acetylowany H2A.Z łączy się głównie z aktywnymi genami w euchromatynie, podczas gdy ubikwitylowany H2A.Z łączy się z fakultatywną heterochromatyną. Podsumowując, włączenie wariantów histonów do nukleosomów zapewnia dodatkowy mechanizm epigenetyczny wykorzystywany przez komórki do modyfikowania struktury chromatyny zgodnie z potrzebami różnych procesów komórkowych.

miRNA

miRNA to małe (o długości około 22-nt) niekodujące RNA, które regulują ekspresję genów poprzez wyciszanie potranskrypcyjne genów docelowych. Swoiste względem sekwencji parowanie miRNA z 3' nieulegającymi translacji regionami docelowego informacyjnego RNA w kompleksie wyciszającym indukowanym przez RNA skutkuje degradacją docelowego informacyjnego RNA lub zahamowaniem translacji. miRNA ulegają ekspresji w sposób specyficzny dla tkanki i kontrolują szeroki wachlarz procesów biologicznych, w tym proliferację komórek, apoptozę i różnicowanie. Lista miRNA zidentyfikowanych w ludzkim genomie i ich potencjalnych genów docelowych szybko rośnie, pokazując ich rozległą rolę w utrzymywaniu globalnych wzorców ekspresji genów. Podobnie jak normalne geny, ekspresja miRNA może być regulowana przez mechanizmy epigenetyczne. Ponadto miRNA mogą również modulować epigenetyczne mechanizmy regulacyjne wewnątrz komórki, celując w enzymy odpowiedzialne za metylację DNA (DNMT3A i DNMT3B) oraz modyfikacje histonów (EZH2). Taka interakcja między różnymi elementami maszynerii epigenetycznej ponownie podkreśla zintegrowaną naturę mechanizmów epigenetycznych zaangażowanych w utrzymywanie globalnych wzorców ekspresji genów.

Zaburzenia epigenomu w nowotworach

Precyzyjny kod epigenomiczny obecny w normalnych komórkach ulega znacznemu zniekształceniu w przypadku nowotworu. Te epimutacje, wraz z szeroko rozpowszechnionymi zmianami genetycznymi, odgrywają ważną rolę w inicjacji i progresji choroby. Epigenom komórek nowotworowych charakteryzuje się globalnymi zmianami wzorców metylacji DNA i modyfikacji histonów, a także zmienionymi profilami ekspresji enzymów modyfikujących chromatynę. Te zmiany epigenetyczne powodują globalną deregulację profili ekspresji genów, prowadzącą do rozwoju i progresji stanów chorobowych. Epimutacje mogą prowadzić do wyciszenia genów supresorowych guza niezależnie, a także w połączeniu ze szkodliwymi mutacjami genetycznymi lub delecjami; w ten sposób służąc jako drugie trafienie wymagane do zainicjowania raka zgodnie z modelem „dwóch trafień” zaproponowanym przez Alfreda Knudsona. Oprócz inaktywacji supresorów nowotworowych, epimutacje mogą również promować nowotworzenie poprzez aktywację onkogenów. Wydarzenia, które prowadzą do zapoczątkowania tych nieprawidłowości epigenetycznych, wciąż nie są w pełni zrozumiałe. Niemniej jednak, ponieważ zmiany epigenetyczne, są mitotycznie dziedziczne, są one selekcjonowane w szybko rosnącej populacji komórek rakowych i zapewniają przewagę wzrostu komórek nowotworowych, powodując ich niekontrolowany wzrost.

Aberracje metylacji DNA

Inicjacji i progresji nowotworu towarzyszą głębokie zmiany w metylacji DNA, które były pierwszymi zmianami epigenetycznymi zidentyfikowanymi w tej chorobie. Epigenom nowotworowy charakteryzuje się hipometylacją całego genomu i hipermetylacją promotora wyspowego CpG specyficzną dla promotorów. Chociaż podstawowe mechanizmy, które inicjują te globalne zmiany, są nadal badane, ostatnie badania wskazują, że niektóre zmiany pojawiają się na bardzo wczesnym etapie rozwoju nowotworu i mogą bezpośrednio przyczyniać się do jego inicjacji.

Globalna hipometylacja DNA odgrywa znaczącą rolę w onkogenezie i występuje w różnych sekwencjach genomowych, w tym w elementach powtarzalnych, retrotranspozonach, słabych promotorach CpG, intronach i pustyniach genów. Hipometylacja DNA w powtarzających się sekwencjach prowadzi do zwiększonej niestabilności genomowej poprzez promowanie rearanżacji chromosomowych. Hipometylacja retrotranspozonów może skutkować ich aktywacją i translokacją do innych regionów genomowych, zwiększając w ten sposób niestabilność genomową. Indukcję niestabilności genomowej przez hipometylację najlepiej zilustrowano u pacjentów z niedoborem odporności i niestabilnością regionu centromerowego, u których występuje mutacja linii zarodkowej w enzymie DNMT3B, co skutkuje hipometylacją, a następnie globalną niestabilnością chromosomów. Podobna utrata metylacji DNA i niestabilność genomu ma związek z różnymi nowotworami ludzkimi. Ponadto hipometylacja DNA może prowadzić do aktywacji genów sprzyjających wzrostowi, takich jak R-Ras i MAPSIN w raku żołądka, S-100 w raku okrężnicy i MAGE w czerniaku. Zatem hipometylacja DNA prowadzi do nieprawidłowej aktywacji genów i regionów niekodujących poprzez różne mechanizmy, które przyczyniają się do rozwoju i progresji nowotworu.

W przeciwieństwie do hipometylacji, która zwiększa niestabilność genomu i aktywuje protoonkogeny, hipermetylacja miejscowo-specyficzna przyczynia się do onkogenezy poprzez wyciszanie genów supresorowych guza. Od czasu początkowego odkrycia hipermetylacji wyspy CpG promotora Rb (gen supresorowy guza związany z siatkówczakiem), różne inne geny supresorowe guza, w tym p16, MLH1 i BRCA1, również ulegają wyciszeniu specyficznemu dla guza poprzez hipermetylację. Geny te biorą udział w procesach komórkowych, które są integralną częścią rozwoju i progresji raka, w tym naprawy DNA, cyklu komórkowego, adhezji komórek, apoptozy i angiogenezy. Wyciszanie epigenetyczne takich genów supresorowych nowotworów może również prowadzić do inicjacji nowotworu, służąc jako drugie trafienie w modelu dwóch trafień Knudsona. Oprócz bezpośredniej inaktywacji genów supresorowych guza, hipermetylacja DNA może również pośrednio wyciszyć dodatkowe klasy genów poprzez wyciszenie czynników transkrypcyjnych i genów naprawy DNA. Wyciszanie genów naprawy DNA (np. MLH1 , BRCA1 itp.) umożliwia komórkom akumulację dalszych zmian genetycznych prowadzących do szybkiej progresji nowotworu.

Chociaż zdolność hipermetylacji DNA do wyciszania genów supresorowych guza w raku jest dobrze znana, sposób, w jaki geny są ukierunkowane na tę nieprawidłową metylację DNA, wciąż nie jest jasne. Jedną z możliwości jest to, że wyciszanie określonych genów przez hipermetylację zapewnia przewagę wzrostu komórek, co skutkuje ich selekcją klonalną i proliferacją. Specyficzna dla nowotworu metylacja wyspy CpG może nastąpić poprzez mechanizm specyficzny dla sekwencji, w którym DNMT są kierowane do określonych genów poprzez ich powiązanie z onkogennymi czynnikami transkrypcyjnymi. Przykładem takiego mechanizmu jest nieprawidłowa hipermetylacja i wyciszanie specyficznych promotorów genów docelowych przez białko fuzyjne PML–RAR w ostrej białaczce promielocytowej. Duże odcinki DNA mogą ulec nienormalnej metylacji w raku powodując hipermetylację niektórych wysp CpG w wyniku ich lokalizacji w takich regionach genomowych, które przeszły przeprogramowanie epigenetyczne na dużą skalę. Inny interesujący mechanizm sugeruje rolę znaczników histonowych w specyficznym dla nowotworu ukierunkowaniu metylacji de novo. Co ciekawe, regiony, które są hipermetylowane w raku, są często wstępnie znakowane znacznikiem polycomb H3K27me3 w komórkach ES, co wskazuje na związek pomiędzy regulacji rozwoju i nowotworzenia. Obserwacja ta częściowo wyjaśnia również teorię „fenotypu metylatora wysp CpG” lub CIMP, która stawia hipotezę, że istnieje skoordynowana metylacja podzbioru wysp CpG w nowotworach, ponieważ wiele z tych loci CIMP jest znanymi celami polycomb. Dalsze zrozumienie, w jaki sposób określone regiony genomu są ukierunkowane na hipermetylację DNA w raku, może potencjalnie prowadzić do dodatkowych celów terapeutycznych.

Zmiany w modyfikacjach histonów

Niedawne postępy w wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu umożliwiły mapowanie zmian chromatyny zachodzących podczas nowotworzenia w całym genomie. Badania te ujawniły globalną utratę trimetylacji acetylowanej H4-lizyny 16 (H4K16ac) i H4-lizyny 20 (H4K20me3). Taka utrata acetylacji histonów, w której pośredniczą HDAC, powoduje represję genów. HDAC są często wykrywane w nadekspresji w różnych typach nowotworów, a zatem stały się głównym celem terapii epigenetycznej. HAT, które współpracują z HDAC w celu utrzymania poziomów acetylacji histonów, mogą również ulec zmianie w przypadku tej choroby. Nieprawidłowe tworzenie białek fuzyjnych poprzez translokacje chromosomalne genów związanych z HAT i HAT (np. MOZ, MORF, CBP i p300) występuje w białaczce. Niewłaściwe ukierunkowanie takich szkodliwych białek fuzyjnych przyczynia się do globalnych zmian we wzorcach acetylacji histonów w raku. 

Oprócz zmian w acetylacji histonów, komórki nowotworowe wykazują również rozległe zmiany we wzorcach ich metylacji. Zmiany we wzorcach metylacji H3K9 i H3K27 są związane z nieprawidłowym wyciszeniem genów w różnych wielu postaciach nowotworów. Rozregulowanie HMT odpowiedzialnych za oznakowania represyjne powoduje zmianę rozkładu tych modyfikacji w DNA i prowadzi do nieprawidłowego wyciszania genów supresorowych nowotworów. Na przykład EZH2, który jest H3K27 HMT, ulega nadekspresji w raku piersi i prostaty. Podwyższone poziomy G9a (H3K9 HMT) zostały wykryte w raku wątroby i biorą udział w utrwalaniu złośliwego fenotypu prawdopodobnie poprzez modulację struktury chromatyny. Translokacje chromosomowe MLL (H3K4 HMT) prowadzą do ekspresji różnych genów homeotycznych (Hox) i odgrywają kluczową rolę w rozwoju białaczki.

Oprócz HMT, w procesie onkogenezy biorą udział również demetylazy specyficzne dla lizyny, które działają w koordynacji z HMT w celu utrzymania globalnych wzorców metylacji histonów. LSD1, pierwsza zidentyfikowana demetylaza lizynowa, może skutecznie usuwać zarówno znaki aktywujące, jak i represjonujące (odpowiednio metylację H3K4 i H3K9) w zależności od swoich specyficznych partnerów wiążących, działając w ten sposób albo jako korepresor lub koaktywator. Po LSD1 odkryto kilka innych demetylaz lizynowych histonów, w tym białka domeny C Jumonji. Kilka z tych HDM jest nadeksprymowanych w raku prostaty, co czyni je potencjalnymi celami terapeutycznymi. Jednakże, ponieważ HDM, takie jak LSD1, mogą pełnić zarówno funkcje aktywujące, jak i represyjne, konieczne jest najpierw zrozumienie ich dokładnej, zależnej od kontekstu roli, zanim ich hamowanie terapeutyczne będzie mogło zostać wykorzystane jako skuteczna strategia leczenia raka. Pomimo tych wyzwań, celowanie w HDM jest obiecującą opcją leczenia na przyszłość, jak wykazały ostatnie badania – hamowanie LSD1 w nerwiaku niedojrzałym powoduje zmniejszoną proliferację in vitro i hamowanie wzrostu heteroprzeszczepu.

Przełączanie epigenetyczne

Jak wspomniano wcześniej, metylacja DNA i modyfikacje histonów działają niezależnie lub wspólnie, zmieniając ekspresję genów podczas nowotworzenia. Kluczowym aspektem takich mechanizmów wyciszania jest tworzenie sztywnego, represyjnego stanu chromatyny, który powoduje zmniejszoną plastyczność komórek. Niedawne odkrycie specyficznych dla nowotworu de novo metylacji Polycomb genów docelowych, które są wyciszone przez H3K27me3 w normalnych komórkach, to kolejny przykład tego fenomenu. W komórkach ES ważne z punktu widzenia rozwoju geny są odwracalnie wyciszane przez białka Polycomb poprzez ustanowienie represyjnego znacznika H3K27me3. Po zróżnicowaniu, geny te są nadal tłumione przez utrzymanie znacznika Polycomb na ich niemetylowanych promotorach przez EZH2. To specyficzne dla nowotworu „przełączenie epigenetyczne” znacznika Polycomb z bardziej stabilną metylacją DNA powoduje trwałe wyciszenie kluczowych genów regulatorowych, które mogą przyczyniać się do proliferacji komórek i nowotworzenia. Jednak nadal nie jest jasne, które czynniki związane z transformacją powodują tę zmianę. 

Rola pozycjonowania nukleosomów

Rola metylacji DNA i modyfikacji histonów w inicjacji i progresji jest dobrze ustalona; jednak zmiany w strukturze chromatyny, które towarzyszą metylacji DNA i zmianom modyfikacji histonów, są mniej poznane. Nowe dane ujawniły, że przebudowa nukleosomów działa w połączeniu z metylacją DNA i modyfikacjami histonów i odgrywa kluczową rolę w wyciszaniu genów specyficznych dla nowotworu. Wyciszanie genów supresorowych wywołane metylacją DNA obejmuje wyraźne zmiany w pozycjonowaniu nukleosomów, co skutkuje lokalizacją nukleosomów w miejscu startu transkrypcji. Reaktywacji takich wyciszonych genów przy użyciu inhibitorów DNMT towarzyszy utrata nukleosomów z regionu promotorowego. Ponadto przebudowa nukleosomów może prowadzić do nieprawidłowego wyciszania genów poprzez przenoszenie represyjnych znaków epigenetycznych na promotory genów supresorowych guza. Ostatnie prace wykazały, że kompleks korepresora deacetylazy i przebudowy nukleosomów (NuRD) odgrywa kluczową rolę w nieprawidłowym wyciszaniu genów w białaczce za pośrednictwem onkogennego czynnika transkrypcyjnego PML–RARa. Kompleks NuRD ułatwia rekrutację represyjnego kompleksu Polycomb 2 i DNMT3A do promotorów genów docelowych PML–RARa, prowadząc do ich trwałego wyciszenia poprzez ustanowienie represyjnego stanu chromatyny. NuRD może być również rekrutowany do metylowanych promotorów poprzez jego interakcję z białkiem domeny 2 wiążącej metyl. Długotrwałe wiązanie NuRD z takimi promotorami może pomóc w zachowaniu ich represyjnego stanu poprzez utrzymanie metylacji DNA.

Zmiany w kompleksie SWI–SNF, kompleksie remodelującym chromatynę zależnym od ATP, są również związane z rozwojem nowotworu. Zniesienie funkcji SWI–SNF poprzez zmiany w jej różnych podjednostkach może skutkować złośliwą transformacją. Podjednostka BAF47 (hSNF5) kompleksu SWI–SNF jest supresorem nowotworowym, a jej hamowanie w guzach powoduje inaktywację szlaków p21 i p16, prowadząc do transformacji. Ponadto BRG1 i BRM, katalityczne podjednostki SWI–SNF, są wyciszone w około 15–20% pierwotnych niedrobnokomórkowych raków płuca. Opracowanie swoistych inhibitorów HDAC, które mogą obejść acetylację BRM, ma zasadnicze znaczenie dla skutecznej indukcji funkcjonalnego BRM w nowotworach, co może być w przyszłości wykorzystane jako prospektywny cel terapeutyczny.

Oprócz kompleksów remodelujących, wariant histonowy H2A.Z jest również powiązany z nowotworzeniem. H2A.Z ulega nadekspresji w kilku typach nowotworów i jest powiązany z promowaniem progresji cyklu komórkowego. Co ciekawe, utrata H2A.Z jest również powiązana z progresją nowotworu poprzez możliwą destabilizację granic chromosomalnych, prowadzącą do rozprzestrzeniania się represyjnych domen chromatyny i de novo hipermetylacji promotorów genów supresorowych. 

Deregulacja miRNA

Zgromadzone dowody z badań porównujących profile ekspresji miRNA w guzach i odpowiadających im tkankach normalnych wskazują na rozległe zmiany w ekspresji miRNA podczas onkogenezy. Ponieważ miRNA regulują geny zaangażowane w regulację transkrypcji, proliferację komórek i apoptozę (najczęstsze procesy związane z onkogenezą), zmiana ich ekspresji może sprzyjać powstawaniu nowotworów. miRNA mogą funkcjonować jako supresory lub onkogeny, w zależności od ich genów docelowych. Wiele miRNA będących supresorami, które są ukierunkowane na geny promujące wzrost, jest hamowanych w onkogenezie. Na przykład miR-15 i 16, które są ukierunkowane na BCL2 , gen antyapoptotyczny, są regulowane w dół w przewlekłej białaczce limfocytowej, podczas gdy miR-7, który celuje w onkogen, RAS , jest regulowany w dół w raku płuc. Ponadto poziom miR-127, którego celem jest BCL6, jest znacznie obniżony w nowotworach prostaty i pęcherza moczowego, a poziom miR-101 , którego celem jest białko z grupy Polycomb EZH2, jest obniżony w raku przejściowokomórkowym pęcherza. W przeciwieństwie do supresorowych miRNA, onkogenne miRNA, które są ukierunkowane na szlaki hamowania wzrostu, są często regulowane w górę w przypadku nowotworów. Na przykład miR-21, którego celem jest PTEN, ulega nadekspresji w ludzkim glejaku. miRNA-155 jest nadeksprymowany w nowotworach piersi i płuc.

Zmiany w ekspresji miRNA mogą być wywołane poprzez kilka mechanizmów, w tym, nieprawidłowości chromosomalne, zaburzenia wiązania czynników transkrypcji i zmiany epigenetycznych. Dla przykładu: miR-127 , supresorowy miRNA osadzony w wyspie CpG, jest wyciszony w raku przez metylację DNA. Ponieważ taką represję epigenetyczną miRNA supresorowych można potencjalnie odwrócić przez leczenie lekami modyfikującymi chromatynę, mogą one służyć jako obiecujące cele terapii epigenetycznej.

Terapia epigenetyczna

Odwracalny charakter głębokich zmian epigenetycznych zachodzących w onkogenezie doprowadził do możliwości „terapii epigenetycznej” jako opcji leczenia. Celem terapii epigenetycznej jest odwrócenie przyczynowych aberracji epigenetycznych występujących w nowotworach, co prowadzi do przywrócenia „normalnego epigenomu”. W niedalekiej przeszłości odkryto wiele leków epigenetycznych, które mogą skutecznie odwrócić metylację DNA i aberracje modyfikacji histonów, które powszechnie występują w nowotworach. Inhibitory metylacji DNA były jednymi z pierwszych leków epigenetycznych proponowanych do stosowania jako leki przeciwnowotworowe. Niezwykłe odkrycie, że leczenie środkami cytotoksycznymi, 5-azacytydyną (5-aza-CR) i 5-aza-2′-deoksycytydyną (5-aza-CdR), prowadzi do zahamowania metylacji DNA i tym samym indukuje ekspresję genów, powodując różnicowanie w hodowanych komórkach doprowadziło do uświadomienia sobie potencjalnego zastosowania tych leków w terapii przeciwnowotworowej. Te analogi nukleozydów są włączane do DNA szybko rosnących komórek nowotworowych podczas replikacji i hamują metylację DNA poprzez wychwytywanie metylotransferaz DNA, co prowadzi do ich wyczerpania wewnątrz komórki. To wywołane lekiem zmniejszenie metylacji DNA powoduje zahamowanie wzrostu komórek nowotworowych poprzez aktywację genów supresorowych nowotworu, które są nieprawidłowo wyciszone w chorych komórkach. 5-Aza-CR (azacytydyna) i 5-aza-CdR (decytabina) zostały obecnie zatwierdzone przez FDA do stosowania w leczeniu zespołów mielodysplastycznych, a obiecujące wyniki przyniosły również wyniki leczenia innych nowotworów hematologicznych, takich jak ostra białaczka szpikowa i przewlekła białaczka szpikowa. Obecnie badane jest możliwe zastosowanie kliniczne innych ulepszonych inhibitorów metylacji DNA, takich jak zebularyna, którą można podawać doustnie.

Możliwość włączenia tych leków do DNA budzi obawy dotyczące ich potencjalnego toksycznego wpływu na normalne komórki. Jednakże, ponieważ leki te działają tylko na dzielące się komórki, można argumentować, że leczenie tymi lekami powinno być ukierunkowane głównie na szybko dzielące się komórki nowotworowe i powinno mieć minimalny wpływ na wolno dzielące się komórki zdrowe. Argument ten został poparty badaniami wykazującymi minimalne skutki uboczne długotrwałego leczenia inhibitorami metylacji DNA. Niemniej jednak aktywnie poszukuje się alternatywnego podejścia polegającego na opracowaniu związków nienukleozydowych, które mogą skutecznie hamować metylację DNA bez włączania do DNA. Opracowanie kilku inhibitorów drobnocząsteczkowych – takich jak SGI-1027, RG108 i MG98 – jest krokiem w tym kierunku. Cząsteczki te mogą osiągnąć swoje działanie hamujące albo przez blokowanie miejsc wiązania katalitycznego/kofaktora DNMT, albo przez celowanie w ich regulatorowe sekwencje informacyjnego RNA; jednakże słaby potencjał hamujący tych leków wskazuje na potrzebę opracowania w przyszłości związków o silniejszym działaniu.

Nieprawidłowe wyciszanie genów jest również związane z jednoczesną utratą acetylacji histonów. Wykazano, że przywrócenie normalnych wzorców acetylacji histonów poprzez leczenie inhibitorami HDAC ma działanie przeciwnowotworowe, w tym zatrzymanie wzrostu, aktywację apoptozy i indukcję różnicowania. W tych antyproliferacyjnych efektach inhibitorów HDAC pośredniczy ich zdolność do reaktywacji wyciszonych genów supresorowych. Suberoiloanilid kwasu hydroksamowego (SAHA), który jest inhibitorem HDAC, został dopuszczony do użytku klinicznego w leczeniu chłoniaka skóry z limfocytów T. Kilka innych inhibitorów HDAC, takich jak depsipeptyd i fenylomaślan, jest obecnie w trakcie badań klinicznych.

Interakcja między różnymi elementami maszynerii epigenetycznej doprowadziła do zbadania skutecznych kombinatorycznych strategii leczenia. Stwierdzono, że takie skojarzone metody są bardziej skuteczne niż indywidualne podejścia terapeutyczne. Na przykład, derepresja pewnych przypuszczalnych genów supresorowych nowotworu była widoczna tylko wtedy, gdy połączono 5-Aza-CdR i trichostatynę A. Efekty przeciwnowotworowe depsipeptydu zostały wzmocnione, gdy komórki białaczkowe były jednocześnie leczone 5-Aza-CdR. Synergistyczne działanie inhibitorów metylacji DNA i HDAC wykazano również w badaniu wykazującym większe zmniejszenie tworzenia się guza płuc u myszy, gdy leczono je fenylomaślanem i 5-Aza-CdR. 

Oprócz inhibitorów metylacji DNA i HDAC, ostatnio aktywnie badane są również inhibitory HMT. Wykazano, że jeden z takich związków inhibitorowych – DZNep – skutecznie indukuje apoptozę w komórkach nowotworowych przez selektywne ukierunkowanie na białka kompleksu 2 represyjnego Polycomb, które na ogół ulegają nadekspresji w onkogenezie. Podczas gdy specyficzność DZNep została zakwestionowana w kolejnym badaniu, odkrycia te wzmacniają potencjał inhibitorów HMT i potrzebę dalszego rozwoju swoistych inhibitorów metylacji histonów.

Podsumowanie

Rewolucja epigenetyczna, która dokonała się w dziedzinie biologii w ciągu ostatnich kilku dekad, podważyła od dawna utrzymywany tradycyjny pogląd, że sekwencja nukleotydowa jest kluczowym wyznacznikiem funkcji genów komórkowych, a jej zmiana jest główną przyczyną chorób człowieka. Postępy poczynione w dziedzinie epigenetyki nowotworów doprowadziły do uświadomienia badaczom, że upakowanie genomu jest potencjalnie równie ważne jak sam genom w regulowaniu podstawowych procesów komórkowych wymaganych do zachowania tożsamości komórkowej, a także w wywoływaniu stanów chorobowych. Głębsze zrozumienie globalnych wzorców tych modyfikacji epigenetycznych i odpowiadających im zmian umożliwiło opracowanie lepszych strategii leczenia. Podejście kombinatoryczne wykorzystujące różne epigenetyczne podejścia terapeutyczne wraz ze standardową chemioterapią daje duże nadzieje na skuteczne leczenie raka w przyszłości. Takie podejście może również pomóc w uwrażliwieniu komórek rakowych, zwłaszcza nowotworowych komórek macierzystych, które są oporne na standardową chemioterapię. Dalsze zrozumienie nowotworowych komórek macierzystych wraz z opracowaniem bardziej specyficznych leków epigenetycznych może być kluczem do naszej zdolności do skutecznego zresetowania nieprawidłowego epigenomu.

Bibliografia