Drukuj
Odsłony: 11850

Sequencing techniques - let there be light!

Paulia Smaruj

Wiceprezes, Koło Naukowe Biologii Molekularnej UW

Pierwsze techniki sekwencjonowania były przełomowe. Pokazały człowiekowi, że poznanie dokładnej kolejności nukleotydów w makromolekułach DNA jest możliwe. Co było kolejnym celem? Robienie tego szybciej, z większą dokładnością i mniejszym nakładem finansowym. Proszę Państwa, wkraczamy w technologie NGS – Next Generation Sequencing, zwane też technikami wysokoprzepustowymi (High Throughput Sequencing Technologies).

Lakoniczna charakterystyka technik sekwencjonowania II generacji:

„I stała się światłość” – pirosekwencjonowanie

Sekwencjonowanie Roche/454 pojawiło się na rynku w 2005 (choć sam pomysł powstał jeszcze w latach 90.). Technika pirosekwencjonowania oparta jest o detekcję pirofosforanu (PPi), który ulega wydzieleniu przy inkorporacji każdego nukleotydu nowosyntetyzowanej nici (czyli podobnie jak metoda dideoksy, zalicza się je do SBS – sequencing by synthesis).

Jednak zacznijmy od początku. Wyobraźmy sobie krótki fragment DNA (jeden z olbrzymiej liczby znajdujących się w bibliotece DNA, którą wcześniej uzyskaliśmy). Naszą makromolekułę przyłączamy do kulki mikroskopijnych rozmiarów (jest zbudowana z substancji paramagnetycznej, w literaturze angielskiej określa się ją jako koralik – bead). DNA jest przyłączone do kulki przez specyficzną sekwencją, określaną jako adapter. Następnym krokiem jest przeprowadzenie nietypowego rodzaju reakcji PCR – w emulsji woda-olej (ang. water-in-oil emulsion PCR, emPCR). Idea jest taka, żeby każdy koralik znalazł się w kropelce wody zwieszonej w oleju (proporcje są tak dobierane, by statystycznie w jednej kropli znalazła się jedna kulka, nie więcej). Przeprowadzamy PCR, skutkiem czego powierzchnia koralika jest pokryta zamplifikowanymi klonami wyjściowej sekwencji. Następnie pokrywamy mieszaniną płytkę zawierającą mnóstwo dołków (ang. picotiter plate) i znów podobna zasada: jedna kulka powinna trafić do jednego dołka.

Teraz przechodzimy do pirosekwencjonowania sensu stricto: po płytce rozprowadzamy mieszaninę enzymów i dNTP. Co dokładnie dzieje się w każdym z dołków? Zachodzą następujące reakcję:

  1. Inkorporacji dNTP komplementarnego do matrycy (zwróćmy uwagę na powstający nieorganiczny pirofosforan):

(DNA)n + dNTP → (DNA)n+1 + PPi + H+

  1. Uwolniony pirofosforan ulega przekształceniu do trifosforanu adenozyny (ATP), reakcję katalizuje sulfurylaza ATP:

PPi + APS → ATP + SO42–

  1. ATP jako kofaktor enzymu lucyferazy pozwala na zajście reakcji utlenienia lucyferyny do lucyferazy, której produktem jest impuls światła:

ATP + lucyferyna + O2 → AMP + PPi + oksylucyferyna + CO2 + ℎ𝑣

Oznaczenia we wzorach: AMP – adenozynomonofosforan; SO42– – anion siarczanowy; AMP – monofosforan adenozyny; CO2 – tlenek węgla (IV); ℎ𝑣 – światło.

Detekcji podlega wydzielany impuls światła (technicznie robi to urządzenie określane jako charged couple device (CCD) znajdujące się pod dołkami). Wynikiem jest odczyt o długości 400-500 nt.

Ryc.1. Poszczególne etapy techniki Roche/454. Fragmenty DNA są początkowo unieruchamiane na mikroskopijnych kulkach, a następnie amplifikowane metodą emPCR. Każdy koralik zostaje w ten sposób pokryty klonami wyjściowej sekwencji. Mieszanina zostaje rozprowadzona po płytce w taki sposób, by jedna kulka trafiła do jednego dołka. Po zainicjowaniu reakcji polimeryzacji, impulsy świetlne są rejestrowane przez urządzenie zlokalizowane pod dołkami.

A teraz rozszerzmy perspektywę, wyjdźmy spoza dołka. Na płytce skewencjonatora znajdują się miliony takich samych dołków, w których zachodzą identyczne relacje chemiczne. Odczyt sekwencji fragmentów DNA pokrywających wszystkie kulki znajdujących się we wszystkich dołkach odbywa się równolegle i w czasie rzeczywistym. Czy już wyczuwacie jak duże możliwości daje ta technika?

Pirosekwencjonwanie ma jednak kilka wad, które po krótce wymienimy:

Technika pirosekwencjonowania była niesamowitym przełomem – otworzyła oczy i umysły na zupełnie nowe, dziesiątki razy szybsze strategie poznania sekwencji kwasów nukleinowych. W przenośni i dosłownie – stała się światłość…

Bibliografia: