Julia Brzykcy

Wydział Biologii UW
Koło Naukowe Biologii Molekularnej UW

Elektroforeza to rozdział cząsteczek z wykorzystaniem ich ładunku elektrycznego. Można jej poddawać DNA, RNA i białka. W praktyce laboratoryjnej, elektroforeza DNA najczęściej wykorzystywana jest do wizualizacji produktów reakcji PCR (polymerase chain reaction), cięcia enzymami restrykcyjnymi lub klonowania. Standardowo stosuje się do tego żele agarozowe. Czasami, gdy zależy nam na rozdziale niewielkich cząsteczek, również żele poliakrylamidowe, klasycznie używane do rozdziału RNA.

Jak przeprowadzić elektroforezę w żelu agarozowym?

W zależności od tego, jakiej wielkości DNA zamierzamy rozdzielić, stosuje się różne stężenia agarozy, odpowiadającej za usieciowanie żelu. Agaroza ma formę proszku i jest polimerem cukrowym pochodzącym ze ściany komórkowej krasnorostów. Im wyższe stężenie, tym cząsteczkom trudniej będzie się przeciskać przez pory, tym dłuższa będzie migracja i wyższa rozdzielczość żelu (możliwy będzie dokładniejszy rozdział cz. DNA o podobnej długości). Agarozę rozpuszczamy w buforze (TAE lub TBE), który dzięki obecności jonów zapewni przepływ prądu przez żel. Krok ten przeprowadzamy w wysokiej temperaturze, np. w mikrofalówce.

Po lekkim ostudzeniu dodajemy do kolby bromek etydyny - barwnik interkalujący między zasady azotowe kwasów nukleinowych. Podczas procedury należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ związek ten jest on również mutagenem i karcynogenem. W trakcie przeprowadzania elektroforezy pozostaje niewidoczny, a jego wizualizację umożliwia dopiero naświetlanie światłem UV. Niekiedy wykorzystuje się bezpieczniejsze zamienniki np. Cyber Green, Cyber Orange.

Tak przygotowany żel wylewamy na poziomą płytkę z pleksiglasu i wprowadzamy do niego grzebień, w celu uformowania studzienek, w których następnie umieścimy nasze próbki. Po zastygnięciu umieszczamy płytkę w naczyniu połączonym ze źródłem prądu i uzupełniamy je buforem (tym samym, który wykorzystywaliśmy do rozpuszczenia agarozy).

Następny etap to wprowadzenie specjalnie przygotowanych próbek do studzienek w żelu. Oprócz DNA, którego rozdział zamierzamy przeprowadzić, znajduje się w nich również  glicerol, zapewniający obciążenie i opadnięcie na dno studzienki oraz inny barwnik - loading dye (np. oranż G, błękit bromofenolowy). W odróżnieniu od bromku etydyny jest widoczny dla naszego oka i pozwala śledzić postęp elektroforezy. Musimy pamiętać również o wprowadzeniu do jednej ze studzienek wzorca wielkości DNA, zawierającego fragmenty markerowe o znanej długości, również ulegające migracji w żelu. 

Aparat zawiera źródło prądu oraz dwie elektrody - anodę i katodę, umieszczone na przeciwległych bokach naczynia. Cząsteczki DNA posiadają ładunek ujemny, nadawany im przez grupy fosforanowe. Dzięki temu, po włączeniu przepływu prądu, w żelu będą migrować w kierunku anody, czyli elektrody dodatniej. Ładunek ujemny posiadają również loading dye i wzorzec wielkości DNA. Szybkość migracji DNA zależy od długości cząsteczki (liczonej w ilościach par zasad) - mniejszym łatwiej jest się przeciskać przez pory w usieciowanym żelu, dlatego migrują szybciej (dalej), niż cz. dłuższe. Kolejny parametr, który wpływa na wynik elektroforezy, to kształtu cząsteczki. DNA kolisty (np. plazmidowy), przybierający formę superskręconą, będzie migrował wolniej, niż DNA liniowe.

Gdy widzimy, że barwnik dodany do próbek dochodzi do końca żelu, należy wyłączyć przepływ prądu. Następnie żel naświetla się światłem UV w transiluminatorze, w celu uwidocznienia prążków DNA. Każdy prążek to nagromadzenie DNA o danej długości, odczytywanej przez porównanie z wzorcem.

Dodaj komentarz


Kod antyspamowy
Odśwież