Jakub Czarny
Wydział Lekarski, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Koło Naukowe Biologii Molekularnej UW
Metodą przełomową dla badań genetycznych okazała się wizja po LSD późniejszego noblisty. Pewnie sądzisz, że to żart… Otóż to całkowita prawda, a jednocześnie wielkie zaskoczenie, jak odwzorowanie procesu zachodzącego w każdej dzielącej się komórce może znaleźć zastosowanie w diagnostyce chorób bakteryjnych, wirusowych, uwarunkowanych genetycznie, wczesnym wykrywaniu nowotworów, medycynie sądowej, transplantologii, a nawet paleontologii.
Mowa tu o wynalezionej przez Kary’ego Mullisa w 1983 roku reakcji PCR, czyli reakcji łańcuchowej polimerazy DNA (ang. Polymerase Chain Reaction). Stanowi ona odwzorowanie procesu replikacji zachodzącej w komórkach, ale jest przeprowadzana w specjalnych urządzeniach, tzw. termocyklerach lub termoblokach. Polega na powieleniu wybranego fragmentu DNA celem zwiększenia ilości DNA do przeprowadzenia bezpośrednich analiz, a przeprowadza się ją w specjalnym roztworze, zwanym buforem, o określonym pH i zawartości soli (sile jonowej).
Składa się z 3 etapów:
• denaturacji,
• tzw. annealingu,
• elongacji.
W pierwszym etapie w termobloku dwuniciowe DNA (takie występuje w komórkach żywych) jest ogrzewane do temperatury >90°C (temperatura może być optymalizowana). W efekcie dochodzi do jego rozplecenia do pojedynczych nici DNA (nici matrycowych) wskutek rozerwania wiązań wodorowych łączących obie nici DNA w podwójną helisę.
W drugim etapie do jednoniciowego DNA przyłączają się dodane do roztworu reakcyjnego krótkie odcinki DNA, zwane starterami, o długości 20–30 zasad. Do roztworu dodajemy zawsze 2 startery: forward (wprost) i reverse (wstecz). Muszą być komplementarne do sekwencji w powielanej nici DNA. Długość starterów i rodzaj zawartych w nich składowych, tj. nukleotydów, determinuje temperaturę zachodzenia tego etapu (zwykle 50–65°C). Startery wyznaczają miejsce powielania DNA i tym samym jego początek (koniec 3’ startera forward) i koniec (koniec 3’ startera forward). Tym samym wiemy też, jak długie będą uzyskiwane odcinki DNA (tzn. z ilu nukleotydów będą się składały).
W trzecim etapie działa odporna na wysokie temperatury polimeraza DNA (np. polimeraza Taq pozyskiwana z bakterii Thermus aquaticus) w obecności kationu magnezu, który jest jej kofaktorem, tzn. umożliwia jej działanie. Tak w temperaturze 72°C polimeraza wydłuża startery i przyłącza kolejne tzw. dNTP (deoksynukleotydy) do kolejnych grup 3’ –OH w tym łańcuchu komplementarnie do nici matrycowej. Tak powstaje nowa nić w kierunku od końca 5’ DNA do końca 3’ DNA.
Tempo namnażania DNA jest wykładnicze, co oznacza, że z 1 cząsteczki DNA po n cyklach reakcji PCR otrzymujemy 2n cząsteczek DNA. Ilustruje to poniższa grafika.
