Julia Szczawińska

Wydział Biologii UW
Koło Naukowe Biologii Molekularnej UW

W celu rozdzielenia białek, zbadania ich masy czy sprawdzenia z jakich podjednostek się składają, w praktyce laboratoryjnej powszechnie stosuje się metodę zwaną SDS-PAGE. Wskazówki, na czym ta metoda polega, można odnaleźć już w rozwinięciu jej nazwy brzmiącej Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis.

Elektroforeza

U podstaw tej metody leży zjawisko elektroforezy polegające na ruchu obdarzonych ładunkiem elektrycznym cząsteczek w polu elektrycznym pod wpływem przyłożenia napięcia. Białka są związkami chemicznymi posiadającymi ładunek elektryczny, zatem rozpuszczone/zawieszone w roztworze elektrolitycznym (roztworze mogącym przewodzić prąd elektryczny), do którego przyłożono napięcie elektryczne, migrują. Białka o ładunku dodatnim wędrują w stronę elektrody ujemnej – katody, a białka o ładunku ujemnym w stronę dodatnio naładowanej elektrody- anody.

Przygotowanie preparatu – istota użycia SDS

Szybkość i kierunek przemieszczania się cząsteczki w roztworze zależą od wypadkowej jej ładunku elektrycznego, jej rozmiaru i kształtu, a także od natężenia pola elektrycznego. Ponieważ wiele czynników wpływa na wynik takiej elektroforezy, trudna jest jego jednoznaczna interpretacja. W celach badawczych najlepiej uzależnić wynik doświadczenia jedynie od jednej zmiennej. SDS-PAGE daje badaczom taką możliwość. W tej metodzie migracja cząsteczek poszczególnych białek zależy jedynie od ich rozmiaru. Osiąga się to poprzez odpowiednie przygotowanie preparatu białkowego obejmujące denaturację oraz ujednolicenie ładunków elektrycznych białek. Denaturacja wysoką temperaturą oraz działaniem dodecylosiarczanu sodu (SDS) niszczy unikalne przestrzenne kształty białek i sprowadza ich budowę do liniowej cząsteczki – zostaje zatem wyeliminowany wpływ kształtu na wynik elektroforezy. Dodatkowo dodecylosiarczan sodu wiąże się z cząsteczkami wszystkich białek, a ponieważ ma on ładunek ujemny, to nadaje go także tym białkom. Bez znaczenia jest ich własny, początkowy ładunek. Wielkość nowego ładunku będzie proporcjonalna do wielkości cząsteczki. W ten sposób wszystkie cząstki będą wędrować w tym samym kierunku – od minusa do plusa – a wielkość ładunku nie będzie wpływała na szybkość migracji. Dzięki wyżej wymienionym procedurom jedynie rozmiar białka zadecyduje o szybkości jego przemieszczania się w roztworze. Najszybciej w stronę anody będą przesuwały się najmniejsze białka. Im większe białko, tym wolniej będzie wędrować i mniejsze odległości do punktu startowego osiągać.

Rola żelu poliakrylamidowego

Aby lepiej uwidocznić różnice w rozmiarach analizowanych białek, SDS-PAGE przeprowadza się w żelu poliakrylamidowym będącym produktem polimeryzacji akrylamidów (organicznych związków chemicznych). Preparat białkowy nakłada się do specjalnych kieszonek (zagłębień w krawędzi płytki wykonanej z żelu), które są miejscami startu. Po przyłożeniu napięcia (jest to możliwe, ponieważ płytka umieszczona zostaje w specjalnym aparacie do elektroforezy) białka zaczynają się przemieszczać w stronę anody. Żel działa jak siatka – białka muszą przeciskać się przez jego pory. Mniejsze białka przechodzą przez pory łatwiej niż te większe i stąd wynikają znaczne różnice w odległościach przez nie przebytych w trakcie trwania rozdziału.

Interpretacja wyników

Podczas rozdziału elektroforetycznego białka są niewidoczne. Dlatego do próbki analizowanej najczęściej dodaje się specjalny barwnik, np.: błękit brylantowy, który także posiada ładunek ujemny. Wędruje on nieco szybciej niż najmniejsze białka, więc moment, kiedy barwnik dociera do końca płytki, wskazuje odpowiedni czas przerwania SDS-PAGE. Białka pozostają niewidoczne także po zakończeniu rozdziału, także aby zobaczyć jego wynik, należy użyć kolejnego barwnika, który połączy się z proteinami. Wtedy w żelu ukażą się paski odpowiadające skupieniom białek o tej samej wielkości uszeregowane od tych najmniejszych do największych. Możemy wyznaczyć masę rozdzielonych białek, porównując wynik otrzymany z badanej próbki ze wzorcem (preparat zawierający białka o znanych masach) lub używając wyliczeń matematycznych.

Dodaj komentarz


Kod antyspamowy
Odśwież