Drukuj
Odsłony: 7616

Dominika Kalinowska

Koło Naukowe Biologii Molekularnej UW

Abstrakt:

Wirus brodawczaka ludzkiego to jedno z tych przekleństw, na które w swoim życiu natkną się niemal wszyscy. Jedni zakażenie przejdą bezobjawowo i pozbędą się wirusa z ciała, inni wykształcą niegroźne brodawki, a niestety u sporej grupy osób rozwinie się nowotwór. Dużo zależy od tego (jak w relacjach międzyludzkich), z jakim typem ma się do czynienia. Szczęśliwie, dostępne są skuteczne szczepionki, które mogą w przyszłości niemal całkowicie wyeliminować problem jednego z najgroźniejszych nowotworów, raka szyjki macicy. Wszystko zależy od tego, czy niektórzy zdejmą foliowe czepki z głów i zaczną realnie dbać o zdrowie swoje i najbliższych. W pracy przedstawione są dzieje wirusa HPV zamknięte w formie gry o królestwie rządzonym przez bezwzględnego króla, któremu przyświeca wyższy cel.

Sobotni wieczór, na dworze wieje chłodem i pada ulewny deszcz, długi spacer przy zachodzie słońca zdecydowanie odpada. Zasiadasz więc przed komputerem, na biurku stawiasz kubek świeżo zaparzonej herbaty. Włączasz komputer, twoim oczom ukazuje się pulpit, a na nim ikona twojej ulubionej gry, którą przeszedłeś już trzy razy. Postanawiasz wprowadzić trochę świeżości do swojego życia, więc szukasz w sklepie z grami nowego tytułu, który porwie cię na długie godziny. W zakładce ze wschodzącymi grami dostrzegasz prawdziwy hit, a do tego za darmo, o wdzięcznym tytule „Virus Kingdom”. Zajmuje niewiele miejsca, znikome wymagania sprzętowe, dla graczy po osiemnastce (seks, przemoc i drastyczne sceny). Według opinii graczy jest niesamowicie wciągająca, niejeden dał się nią zarazić przez znajomego. Bez dłuższego zastanawiania się, pobierasz i instalujesz grę. Po uruchomieniu włącza się samouczek, który oprowadza cię po grze. W świecie gry wcielasz się w szalonego naukowca, wiernego sługę potężnego władcy królestwa odizolowanego od reszty świata. Surowy król postanowił przed laty rozpocząć bezwzględne, obfitujące w ofiary badania. Mianowicie, chciał stworzyć rasę ludzi odpornych na wszelkie choroby. Powołał w tym celu sztab naukowców odpowiedzialnych za przeprowadzanie mutacji wśród ludu, produkcję niezawodnych szczepionek oraz tworzenie coraz silniejszych czynników zakaźnych, by testować odporność poddanych. W tej historii dowodzisz trzecim spośród brutalnych sztabów. Podczas rozgrywki wykonujesz przeróżne misje, dzięki którym otrzymujesz substancje i przyrządy umożliwiające modyfikowanie aktualnie badanego wirusa. Na dobry początek rozpoczynasz pracę nad wirusem z rodziny Papillomaviridae. Łacińska nazwa szybko staje się jasna, mianowicie wirusem, nad którym będziesz pracować, jest HPV. Przed tobą jego podstawowe statystyki:

HPV (ang. human papilloma virus, wirus brodawczaka ludzkiego)
Rodzina: Papillomaviridae
Materiał genetyczny: kolista cząsteczka dsDNA
Kształt kapsydu: ikosaedryczny
Średnica kapsydu: 55 nm
Osłonka lipidowa: brak
Transmisja: przez dotyk i kontakty seksualne

Zapoznawszy się z podstawowymi danymi technicznymi, stwierdzasz, że urzekła cię ta klasyka. Wirus będzie świetnie się roznosić, gdyż chyba żaden mieszkaniec królestwa nie stroni od seksu (a już na pewno każdy podaje innym dłoń!). Czynnikami zwiększającymi ryzyko zakażenia jest posiadanie wielu partnerów seksualnych, seks bez zabezpieczenia oraz choroby współistniejące (infekcja HIV, HSV czy chlamydią). Wpływ na prawdopodobieństwo zakażenia mają również płeć i wiek, mianowicie wysoce narażone są dziewczęta rozpoczynające życie seksualne. Szacuje się, że zarażona wirusem HPV jest ponad połowa aktywnych seksualnie młodych dorosłych, jednak większość infekcji przebiega bezobjawowo i jest zwalczana przez układ odpornościowy. Sposób, w jaki wirus HPV przeprowadza swój cykl replikacyjny, stanowi wyzwanie dla badaczy. Standardowe badania opierają się na hodowli komórkowej, która w tym przypadku jest niemożliwa. HPV namnaża się wyłącznie w różnicującym się wielowarstwowym nabłonku płaskim, który nie nadaje się do tej metody. Taki nabłonek występuje w narządach płciowych, w przewodzie pokarmowym (krtani czy odbycie), a także buduje naskórek. Miejsce namnażania się wirusów wyraźnie sugeruje, gdzie będą powstawać zmiany. Szacuje się, że typów HPV jest ponad 200. Rodzaj zmiany obserwowanej u pacjenta wskazuje na dominujący dla niej typ HPV. Wyróżnia się dwie grupy zmian – zmiany najczęściej łagodne oraz zmiany złośliwe lub potencjalnie złośliwe. Zmiany łagodne to różnego rodzaju brodawki. W księdze dotyczącej aspektów klinicznych i patologicznych HPV odnajdujesz spis różnych zmian łagodnych.

Brodawki zwykłe (łac. verrucae vulgares)
Umiejscowienie: skóra
Dominujące typy HPV: 2, 4
Brodawki płaskie (łac. verrucae planae)
Umiejscowienie: skóra
Dominujące typy HPV: 3, 10
Brodawki dłoni i podeszwowe (łac. verrucae palmares et verrucae plantares)
Umiejscowienie: dłonie i stopy
Dominujące typy HPV: 1, 2, 4
Brodawki płciowe (kłykciny kończyste; łac.  condylomata acuminata)
Umiejscowienie: srom, pochwa, prącie (głównie żołądź i napletek), cewka moczowa, odbyt
Dominujące typy HPV: 6, 11
Brodawczakowatość młodzieńcza krtani (łac. papillomatosis laryngis juvenilis)
Umiejscowienie: krtań
Dominujące typy HPV: 6, 11

Brodawek można pozbyć się używając podofiliny, kwasu salicylowego o działaniu keratolitycznym (usuwa martwy naskórek), poprzez krioterapię ciekłym azotem lub laserowo. Łagodne brodawki oczywiście są interesujące, jednak zdecydowanie bardziej ciągnie cię do HPV powodujących zmiany nowotworowe. Spis najważniejszych znajduje się na następnej stronie księgi, a oto jego fragment.

Rak (łac. carcinoma)
Umiejscowienie: szyjka macicy, penis, odbyt
Dominujące typy HPV: 16, 18
Dysplazja Lewandowsky’ego-Lutza (zespół człowieka drzewa; łac. epidermodysplasia verruciformis)
Umiejscowienie: skóra
Dominujące typy HPV: 5, 8, 14
Grudkowatość bowenoidalna (ang. bowenoid papulosis)
Umiejscowienie: błony śluzowe penisa i sromu
Dominujące typy HPV: 16

Po wykonaniu wstępnego przeglądu, spośród najbardziej niebezpiecznych (a tym samym budzących ciekawość) typów, decydujesz się skupić nad wirusem HPV-16. Postanowiłeś odłożyć badania nad HPV-18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, i -68 na później. Chociaż zastanawiałeś się chwilę nad HPV-18 i HPV-58, to nie one skradły ci serce. Imponujące statystyki epidemiologiczne (jest głównym typem HPV odpowiedzialnym za występowanie raka szyjki macicy) oraz niebezpieczeństwo płynące z infekcji zdecydowanie przykuwają uwagę. Twoją postać czekają miesiące badań nad wirusem, wyłapywanie oraz obserwacja osób nim zarażonych. Na początku konieczne jest pobranie materiału do badań od możliwie największej grupy osób (w tym przypadku kobiet chorych na raka szyjki macicy, którego trzeba u nich potwierdzić). Najpierw specjalną szczoteczką pobiera się komórki, a następnie wykonuje badanie cytologiczne (ang. Pap test), które pozwoli wykryć nieprawidłowości w budowie komórek. Kolejnym krokiem jest test HPV, który potwierdzi obecność DNA konkretnego wirusa. Nadchodzi czas na PCR metodami Sangera i Next-Generation Sequencing (niestety, pomimo posiadania testu, cały genom nie był dostępny). Dogłębna analiza doprowadza cię do bardzo istotnych informacji na temat HPV-16. Genom wirusa składa się z około 7900 par zasad, budują go trzy zasadnicze sekcje – URR, wczesna i późna. URR (ang. upstream regulatory region) to region nieulegający transkrypcji odpowiadający za regulację, pełni funkcję promotora i enhancera. Znajdują się w nim domeny wiążące czynniki transkrypcyjne, sekwencja ori. Tuż za tą sekwencją znajduje się sekcja wczesna. Składają się na nią geny wczesne E6, E7, E1, E2, E4 oraz E5. Białko E1 reguluje translację, E2 translację i replikację, E4 pełni ważną funkcję w uwalnianiu wirusów (jego „wczesność” może być myląca, gdyż jest bardziej aktywny przy ekspresji genów późnych), a E5 zmniejsza ekspresję MHC I (co pozwala wirusowi uniknąć limfocytów T). Wśród genów wczesnych najbardziej interesujące są E6 i E7, które mają zdolność wiązania białek supresorowych cyklu komórkowego, wywołując transformację komórki i w konsekwencji onkogenezę. Jednym z tych białek jest p53 (o masie 53 kDa), które, tworząc aktywne tetramery, zatrzymuje komórkę w fazie G1, powoduje represję transkrypcji i wykazuje działanie proapoptotyczne. Oprócz tego, reguluje działanie p21, które zaburza tworzenie kompleksu CycD/CDK4, dzięki czemu uniemożliwia fosforylację pRb (o którym później). Jednak geny wirusa muszą ulegać ekspresji, więc p53 jest wirusowi nie w smak i ma przeciw niemu broń, E6. E6 oraz E6-AP (ang. E6-associated protein) przyłączają się do p53, następnie E6 odłącza się, co daje komórce znak do ubikwitynacji tetrameru. Każda podjednostka zostaje wyposażona w 4 reszty ubikwitynowe i prowadzona do proteasomu na proteinową egzekucję. Nieco inaczej działa E7, którego celem jest wcześniej wspomniany pRb (białko retinoblastoma, którego nazwa wzięła się stąd, że jego brak wywołuje siatkówczaka). pRb tworzy kompleks z E2F i DP, który hamuje syntezę białek fazy S cyklu komórkowego. Odłączenie pRb (przez jego fosforylację) od tego kompleksu pozostawia heterodimer E2F i DP, którego obecność stymuluje syntezę białek fazy S (takich jak polimeraza DNA), a tym samym umożliwia replikację DNA oraz przeprowadzenie dalszych faz cyklu. Białko E7 ma zdolność łączenia się z pRb i tym samym odłączenia tego białka od kompleksu, co stymuluje syntezę białek fazy S. Komórka wchodzi na ścieżkę niekontrolowanych podziałów, ulega transformacji, a to już krótka droga do powstania nowotworu.

HPV powodują 5% wszystkich nowotworów na świecie. Infekcje HPV stanowią przyczynę niemal wszystkich przypadków nowotworów szyjki macicy (w 70% przez HPV-16 i HPV-18), około 50% nowotworów pochwy i nowotworów prącia. Rak szyjki macicy należy do trzech najczęściej występujących nowotworów u kobiet, jego przyczyną jest niemal zawsze infekcja HPV. Co czyni szyjkę macicy tak podatną na zakażenia HPV i występowanie nowotworów? Wynika to z jej anatomii. W szyjce macicy znajduje się strefa przejściowa między nabłonkiem jednowarstwowym walcowatym (w części leżącej bliżej macicy) a wielowarstwowym płaskim (występującym bliżej pochwy). To miejsce jest szczególnie podatne na onkogenezę spowodowaną infekcją HPV. Jak przebiega droga od zakażenia do wykształcenia nowotworu? Wszystko zaczyna się od mikrourazów nabłonka, które odsłaniają warstwę komórek podstawnych. Komórki podstawne to komórki macierzyste nabłonka, które intensywnie się dzielą. Wirus po wniknięciu do takiej komórki może przeniknąć do jej jądra i zacząć się namnażać, co początkowo nie jest szczególnie intensywne, aby nie wejść w drogę układowi immunologicznemu. Wirus zaczyna rozprzestrzeniać się do warstwy kolczystej, a tkanka wchodzi w fazę CIN 1 (cervical intraepithelial neoplasia grade I; neoplazja wewnątrznabłonkowa szyjki macicy I stopnia), co cytologicznie odpowiada śródnabłonkowym zmianom dysplastycznym małego stopnia (ang. LSIL low-grade squamous intraepithelial lesion). W tej fazie może występować koilocytoza. Zmiany te są odwracalne i tkanka jest w stanie powrócić do normalności. Gdy jednak zmiana zaczyna przewyższać ⅓ wysokości nabłonka, zaczyna być mowa o śródnabłonkowych zmianach dysplastycznych dużego stopnia (ang. HSIL high-grade squamous intraepithelial lesion). Pierwszą z faz HSIL jest CIN 2, w której zmiana sięga ⅔ wysokości nabłonka, a jądra komórkowe wykazują polimorfizm. Drugą fazą jest CIN 3, w której wyróżnia się trzy etapy. Pierwszym z nich jest poważna dysplazja, w której nieprawidłowe komórki zajmują już niemal całą wysokość nabłonka, a poziom ekspresji E6 i E7 znacznie wzrasta. Wysoka ekspresja E6 i E7 prowadzi do powstania raka ograniczonego do szyjki macicy (ang. carcinoma in situ – rak w miejscu). Niewykrycie wcześniejszych zmian w odpowiednim czasie może doprowadzić do powstawania przerzutów do innych tkanek – pęcherza moczowego, odbytnicy czy węzłów chłonnych (co jest podstawą do dalszych przerzutów). Terapia raka szyjki macicy może polegać na wycięciu jej fragmentu bądź całości (wraz z węzłami odprowadzającymi chłonkę z macicy), radio- lub chemioterapii.

Jednak wiadomo, że lepiej zapobiegać niż leczyć. Więc w międzyczasie trwają badania nad szczepionkami, w które również angażuje cię twoja obecna misja. Aby stworzyć dobrą szczepionkę, najpierw trzeba zapoznać się jeszcze z późnymi genami HPV-16, czyli z L1 i L2. Geny te kodują białka budujące kapsyd wirusa. L1 tworzy 72 pentamery połączone mostkami disiarczkowymi, a L2 tworzy 72 jednostki. Współpraca sztabów doprowadziła do opracowania technologii tworzącej VLP (ang. virus-like particles). Te cząsteczki zbudowane są jedynie z pentamerów L1 połączonych mostkami disiarczkowymi, czyli można ująć, że to sam niedorobiony kapsyd. VLP używacie do stworzenia aż trzech skutecznych szczepionek prewencyjnych, czyli takich, które nadają odporność przed zakażeniem i są nieskuteczne w trakcie. Wraz z Gerwazym Stefanem Kowalskim (w skrócie GSK) opracowujesz szczepionkę o wdzięcznej nazwie Cervarix. Cervarix wytwarza odporność przeciwko HPV-16 i HPV-18 i zdecydowanie zmniejsza ryzyko wystąpienie nowotworów szyjki macicy i prącia. Produkowany jest w komórkach owadów. Ty jednak chcesz popracować na drożdżach, więc wraz z Markiem Merckiem opracowujesz kolejną szczepionkę, Gardasil. Gardasil jest skuteczny nie tylko przeciw HPV-16 i HPV-18, ale także przeciw HPV-6 i HPV-11, czyli zapewnia dodatkową ochronę przeciw brodawkom. Owocem nieodpartej chęci stworzenia szczepionki przeciwko jeszcze większej liczbie typów jest Gardasil-9, który, jak sama nazwa wskazuje, wytwarza odporność przeciwko dziewięciu typom HPV (16, 18, 6, 11, 31, 33, 45, 52, 58). To zapewnia dodatkową ochronę przeciw nowotworom. Gotowe szczepionki: Cervarix, Gardasil i Gardasil-9 podano odpowiednio trzem dużym grupom nadwornej młodzieży. Schemat podawania szczepionki na HPV to 0, 1 i 6 miesięcy, czyli wymagane są trzy dawki. Po tym czasie, a także po wielu latach od zaszczepienia, zdecydowanie zmalała liczba przypadków powikłań związanych z HPV. Wśród badanych grup odnotowano 90% skuteczność szczepień. To naprawdę niezwykłe osiągnięcie.

Twoja grupa badawcza otrzymuje od króla dofinansowanie na dalsze badania oraz symboliczny uścisk ręki (miejmy nadzieję, że bez niespodzianki w postaci HPV). Władca jest zdumiony efektami pracy twojego sztabu, jednak jest żądny coraz to lepszych efektów i stuprocentowej skuteczności. Mimo swojej bezwzględności i brutalności, przyświeca mu pewna szczytna idea, by jego przyszły lud był wolny od chorób, skoro jest to możliwe. Zwraca szczególną uwagę nie tylko na odporność osobniczą, ale też odporność grupową. Im mniej nosicieli wirusa, tym mniejsze prawdopodobieństwo, że inni zostaną zainfekowani.

Dzięki otrzymanym środkom twoja grupa badawcza rozpoczyna badania nad szczepionką, która potencjalnie będzie mogła wytworzyć mechanizm odporności komórkowej przeciwko komórkom już zarażonym HPV. Białka E2 wirusa HPV-16 oraz ludzkie białko p16INK4a (ulegające ekspresji w wyniku ekspozycji na białko E7) zawierają determinanty antygenowe (epitopy), które wykazują duży potencjał w stymulacji MDC CD83+ (ang. monocyte-derived dendritic cells) na drodze MAPK (ang. mitogene-activated protein kinases), która prowadzi do ich dojrzewania. Dojrzałe komórki dendrytyczne są zdolne do prezentowania antygenu poprzez MHC klasy I oraz MC klasy II. Zaprezentowany antygen aktywuje limfocyty T CD4+ (helpery) i CD8+ (cytotoksyczne), zdolne do produkcji IFN-γ. Interferon gamma pełni bardzo ważną funkcję w infekcjach wirusowych, pobudza do działania makrofagi. Limfocyty CD8+ są zdolne do uśmiercenia komórek zakażonych wirusem i nowotworowych, więc potencjalna szczepionka byłaby skuteczna również w późniejszych stadiach postępu choroby.

To była długa, porządna sesja grania. Myślisz o tym, co ciekawego będziesz robić jutro, a potem orientujesz się, że owo „jutro” trwa już od pięciu godzin. Faktycznie, analizując wirusa i przygotowując szczepionki, za oknem zrobiło się dziwnie jasno.

Bibliografia: